在《Biacore檢測蛋白與小分子相互作用的常見問題（上）》中我們著重介紹了在實驗設計以及樣品準備方面的問題，在本文的下篇中，我們還是從智薈專線收集的客戶咨詢出發，將繼續討論在實驗進行過程中和最終的數據分析階段可能遇到的常見問題，并逐一揭開上篇中遺留的各個懸念……

一、 關于溶劑校正的問題

溶劑校正流程貫穿于前期的樣品準備、之后的樣品檢測以及最后的數據分析，是檢測蛋白與小分子相互作用實驗中非常關鍵的一個步驟，也是Biacore檢測蛋白與小分子互作的一大優勢。

什么情況下需要進行溶劑校正？

當運行緩沖液中含有高折光率（refractive index）的成分，且此時在活通道上的配體量較高時，運行緩沖液流經活性通道時會存在一定的體積排阻效應，導致活性通道與參比通道上的信號存在差異[1]（如下圖1所示）。

1. 運行緩沖液的高折光率與高偶聯造成活性通道與參比通道的信號差異[1]。

如果運行緩沖液以及不同濃度的分析物樣品的折光率能保持嚴格一致，則上述的通道間差異也是一個定值了，將不會對最終互作結果產生影響；然而實際情況下，由于樣品配制誤差等原因，緩沖液與分析物樣品間的折光率誤差往往難以避免。以DMSO為例，1% DMSO的加入會導致響應值信號上升約1200 RU[1]，而小分子分析物本身與配體結合產生的響應值是較小的，因此DMSO濃度的微小變化也會引起顯著的影響。此時就需要進行溶劑校正，來修正這種由于高折光率物質（例如DMSO等）濃度的細微偏差導致的響應值信號顯著變化，得到最準確的互作數據。

2如何進行溶劑校正？

以最常見的DMSO為例，溶劑校正的核心思路是設置一系列含有不同濃度DMSO的校正溶液，濃度范圍覆蓋實驗中所用的DMSO濃度（例如運行緩沖液和分析物樣品中均含5% DMSO，則校正溶液中濃度范圍可以是4.5% - 5.8%），以此來包含樣品與buffer配制過程中引入的DMSO濃度的誤差。使校正溶液按照濃度順序（從低到高或者從高到低）依次進樣，流經參比通道與活性通道后，以參比通道的響應值為橫坐標、活性通道扣減參比通道的響應值為縱坐標進行作圖，得到溶劑校正曲線（如下圖2所示）。根據樣品在參比通道的信號，就可以通過校正曲線對應得到活性通道扣減參比通道的校正值。而此過程在Biacore上，都是全自動完成的，有專用向導式程序指引，無需手動操作。

2. 典型的溶劑校正曲線示意圖[1]。

3

如何判斷溶劑校正的結果是否正常？

如果按照上述的例子，對含有5% DMSO的樣品以4.5% - 5.8%的范圍進行溶劑校正，最終得到的溶劑校正曲線橫坐標范圍一般要落在-500 到 +1000 RU，校正曲線圖譜中的兩條豎線代表的是分析物中DMSO濃度范圍，要求落在校正曲線的范圍內，并且擬合的Chi2值小于2[1][2]。

如果溶劑校正的結果出現異常，可以留意以下幾方面的問題：（1）建議使用高品質的DMSO試劑，并且使用相同來源的DMSO溶解小分子和配制所需溶液。（2）注意校正溶液的配制策略，例如只需配制含4.5%和5.8% DMSO的這兩種緩沖液，中間梯度通過這兩種溶液按照不同比例混合得到，而不需要一個個單獨配制。（3）由于DMSO具有吸潮的性質，在配制過程中應及時封閉，避免長時間敞口放置；在上機檢測時，也應該對樣品管進行密封。為此，Biacore獨特的全密閉樣品艙設計，及配套專用的孔板封膜及EP管橡膠蓋就派上用場了。

關于溶劑校正步驟的具體操作方法，可以掃描文末二維碼，查閱《Easy Biacore: T200 檢測蛋白與小分子結合》中的相關內容。

二、結果分析中的相關問題

正確的溶劑校正是后續進行數據分析的前提，得到最終可分析的結果后，可能還面臨下面這些問題。

1

應該選擇哪種擬合模式？

關于擬合模式的選擇，是選擇動力學（Kinetics）分析還是親和力（Affinity）分析，主要是根據響應值圖譜的形狀來判斷的。對于動力學分析，要求響應值圖譜在結合和解離階段均展現出足夠的曲率（“慢結合慢解離”），而親和力分析則要求在每次的分析物進樣階段均達到穩態（steady state）。對于同時滿足兩種要求的響應值圖譜，理論上兩種分析模式均可以使用。關于不同響應值圖譜形狀以及可選的擬合模式，可參考如下圖3[3]。

3. 不同形狀的響應值圖譜與適用的擬合模式的對應關系示意圖[3]。

如同在上篇所提到的，蛋白與小分子的相互作用在大部分情況下是“快結合快解離”的，在結合與解離階段的曲線未能呈現足夠的曲率，而在每次分析物進樣后，曲線快速上升并達到平臺，因此適用于親和力（Affinity）分析。而在解離階段曲線快速下降至接近基線的特點，也使得蛋白與小分子互作檢測中一般不需要設置額外的再生步驟。

2

如何判斷擬合結果的好壞？

這是很多實驗者在面對自己的實驗結果時會發出的“靈魂拷問”，同樣也是Biacore另一個獨特優勢體現之處：具有智能數據質量評估系統，能夠以圖形化顯示方式來評估檢測結果。能夠對檢測結果自動進行統計學分析，并給出相應參數，以此判斷數據可信度與準確度。由于篇幅有限，我們這里主要討論蛋白與小分子互作常用的親和力分析結果的評價。

是使用Biacore結果分析軟件得到的典型的親和力分析結果，在Report界面，顯示的參數有KD（以M為單位）、Rmax、offset以及Chi2，相應的判斷標準如下：

1

擬合得出的KD值（即擬合曲線中豎線所在的橫坐標值）應該盡可能落在分析物濃度范圍之內，最好在最高濃度的一半以內。

2

當擬合得到的實際Rmax值顯著高于理論計算值時，說明結合反應未按照1：1的化學計量比進行，有可能出現了非特異性結合或者分析物分子的聚集。對于小分子樣品來說，往往由于溶解度等問題發生聚集導致上述現象。而造成擬合得到的實際Rmax值低于理論計算值的原因，主要還是偶聯的配體中有一定比例的分子未充分暴露結合活性。如果上述兩種情況同時存在，此時僅通過Rmax值難以判斷，需要通過其他實驗結果來驗證。

3

offset代表的是零濃度時的響應值，這個值應該趨近于0；如果出現了異常高的值或者負值，需要檢查參比通道和零濃度的響應值 [3] 。

4

Chi2值反映了擬合結果與實驗數據的接近程度，這個值越小，代表實驗結果與擬合模型越接近。

4. Biacore分析軟件中典型的親和力擬合結果界面 [2] 。

3

 關于非特異性吸附的問題

非特異性吸附的來源是多樣的，最常見的應該是分析物分子在參比通道芯片表面的吸附，其次可能還來源于分析物樣品中其他雜質成分在參比通道或者配體上的非特異性結合，甚至還可能是分析物分子在配體上的吸附（例如小分子在配體蛋白非活性位點的弱結合等）。要判斷是否存在非特異性吸附，最主要的判斷依據是看Binding to reference這部分參數，該參數反映了每個循環的分析物在參比通道上的吸附情況。作為建議，可以按照以下標準判斷：如果Binding to reference的值大于活性通道扣減參比通道（如Fc=2-1）得到信號值的20%，則可以認為存在較顯著的非特異性吸附。

要解決非特異性吸附問題，主要可以從以下三方面入手：

1

改變芯片表面或者分析物的性質。比較直接的方法是調換配體與分析物的位置，即固定會發生非特異性吸附的原分析物，將原配體作為分析物流經芯片表面進行分析。然而在蛋白與小分子的互作實驗中，固定小分子會面臨諸多問題（如上篇中所述），因此這個方案在解決小分子的非特異性吸附中不常用。其次可以考慮改變參比通道的處理方法。在使用CM系列芯片偶聯配體進行檢測時，參比通道可以不作任何處理，也可以進行活化與封閉。這兩種處理方式下的芯片表面性質有所不同，改變處理方式或許可以減弱非特異性吸附。另外，非特異性吸附的來源還可能是分析物中的雜質，那么提高分析物的純度可能也有助于減弱這種吸附。

2

改變緩沖液條件抑制吸附的發生。非特異性吸附發生所依賴的作用力主要就是離子型相互作用或者疏水型相互作用，前者可以通過提高離子強度來抑制，而后者可以通過添加一定濃度的表面活性劑進行屏蔽。常規緩沖液中NaCl濃度在150 mM附近，可以考慮在原運行緩沖液中額外添加鹽（至~300 mM甚至500 mM）。Cytiva提供含有表面活性劑P20的運行緩沖液，工作濃度一般為0.05%。需要注意的是，在提高鹽濃度或者加入表面活性劑的過程中，配體與分析物的相互作用可能也會受到一定程度的影響。

3

調整分析物的濃度范圍。非特異性吸附往往呈現出非常明顯的濃度相關性。對于小分子分析物，有可能發生的情況是，當濃度達到某個值以上時，小分子的溶解情況出現變化，容易發生聚集沉淀等問題，導致非特異性吸附的信號陡然上升。對于上述情況，可以考慮調整分析物的濃度范圍，將非特異性吸附的信號控制在相對不顯著的范圍之內進行實驗。當然，分析物的濃度范圍的確定還要考慮KD擬合的需要（如上篇中所述），因此這個方法不一定能找到合適的濃度范圍。

面對實際出現的非特異性吸附問題時，往往是以上三方面綜合考慮，進而嘗試解決。

至此，關于Biacore檢測蛋白與小分子互作的實驗進行步驟和數據分析過程的常見問題也已分享完畢。一個成功的Biacore實驗需要在實驗設計、樣品準備以及結果分析等各階段進行問題的排查與調整，檢測蛋白與小分子互作的實驗中可能會出現形形色色的問題，但是造成這些問題的主要原因應該都在這兩篇討論的內容中了，很多情況下未知的現象往往是已知的原因導致的。萬變不離其宗，希望這上下兩篇的分享能給大家帶來一些提示與啟發。

文章來源：https://mp.weixin.qq.com/s/5MifecpYb03DUZ_sLj15sQ